MTHFD1 억제 암세포에서 포름산 오버플로가 독성 엽산 트래핑을 유도합니다.

Nature Metabolism 5권, 642~659페이지(2023)이 기사 인용

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암세포는 메틸렌테트라하이드로폴레이트 탈수소효소-사이클로하이드로라제 1 및 2(MTHFD1 및 MTHFD2) 효소를 포함하여 1탄소(1C) 대사를 상향 조절함으로써 뉴클레오티드 공급에 대한 필요성 증가를 촉진합니다. TH9619는 MTHFD1과 MTHFD2 모두에서 탈수소효소와 시클로가수분해효소 활성의 강력한 억제제이며 선택적으로 암세포를 죽입니다. 여기에서 우리는 세포에서 TH9619가 핵 MTHFD2를 표적으로 삼지만 미토콘드리아 MTHFD2를 억제하지 않는다는 것을 밝힙니다. 따라서 TH9619가 있는 경우 미토콘드리아에서 포름산염이 계속해서 흘러나옵니다. TH9619는 미토콘드리아 포름산염 방출 하류에서 발생하는 MTHFD1의 활성을 억제하여 10-포르밀-테트라히드로엽산의 축적을 유도하며, 이를 '엽산 트랩'이라고 합니다. 이로 인해 티미딜레이트가 고갈되고 MTHFD2 발현 암세포가 사망하게 됩니다. 이전에 특성화되지 않은 이러한 엽산 포획 메커니즘은 새로운 퓨린 합성 경로를 차단하고 추가로 퓨린 합성을 위한 10-포르밀-테트라히드로엽산 소비를 방지하는 생리학적 하이포크산틴 수준에 의해 악화됩니다. TH9619에 대해 여기에 설명된 엽산 포획 메커니즘은 다른 MTHFD1/2 억제제 및 항엽산제와 다릅니다. 따라서 우리의 연구 결과는 암을 공격하는 접근법을 밝혀내고 1C 대사의 조절 메커니즘을 밝힙니다.

1탄소(1C) 대사는 DNA 합성 및 복구를 위한 뉴클레오티드 공급의 핵심입니다. 증식 요구를 충족할 만큼 충분한 뉴클레오티드 공급이 없으면 세포는 복제 스트레스 및 게놈 불안정성으로 인해 세포 주기 정지 또는 세포 사멸을 겪게 됩니다. 1C 대사 경로에 관여하는 효소는 일반적으로 암에서 상향 조절되어 빠른 증식에 필요한 뉴클레오티드와 아미노산을 생성합니다4,5,6.

1C 대사는 주로 해당과정의 중간체인 3-포스포글리세레이트에서 생성되거나 세포외 공간에서 공급될 수 있는 비필수 아미노산인 세린에 의해 촉진됩니다7. 엽산 의존성 1C 대사를 통한 세린의 이화작용은 뉴클레오티드 합성에 필요합니다. 이는 미토콘드리아와 세포질에서 발생하는 4가지 가역적 효소 반응에 의해 매개됩니다(그림 1a). 세린 하이드록시메틸 전이효소(SHMT)는 세린에서 테트라하이드로폴레이트(THF)로 하이드록시메틸 그룹을 전달하여 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트(CH2-THF)와 글리신을 생성합니다. 메틸렌테트라하이드로폴레이트 탈수소효소-사이클로하이드롤라제(MTHFD)는 CH2-THF를 10-포르밀-테트라하이드로폴레이트(10-CHO-THF)로 산화 및 가수분해한 다음, 포르밀 THF 합성효소에 의해 THF와 포름산염으로 가수분해됩니다. 세포질에서 이러한 반응은 SHMT1과 2개의 별개 도메인인 탈수소효소-사이클로하이드롤라제(DC) 도메인과 포르밀 THF 합성효소(FS) 도메인으로 구성된 삼중 기능 MTHFD1에 의해 촉매됩니다. 미토콘드리아에서는 동일한 반응이 SHMT2, 이중기능성 MTHFD2(DC 활성) 및 MTHFD1L(FS 활성)에 의해 촉매됩니다(그림 1a)8. 변형이 존재하더라도 경로의 표준 방향성은 세린 이화작용과 미토콘드리아를 통한 1C 단위 산화를 따르는 반면, 세포질 1C 단위는 높은 세포질 NADPH:NADP+ 비율8,10,11,12에 의해 구동되는 환원(역) 경로를 따릅니다. 이런 식으로 1C 대사는 미토콘드리아와 세포질 사이에 퍼지는 순환을 형성합니다. SHMT1 및 MTHFD1 촉매 반응의 가역성으로 인해 미토콘드리아 1C 대사 손실은 세포질 경로를 통해 보상될 수 있습니다.

a, 미토콘드리아와 세포질/핵 사이의 1C 대사 플럭스. b-e, 50μM 티미딘, 1mM 포름산나트륨 또는 비히클의 존재하에 TH9619(b), TH9975(c), DS18561882(d) 또는 SHIN1(e)로 96시간 동안 처리된 SW620 세포의 용량-반응 곡선( RPMI-FBS에서 배양됨)은 ± sd(n = 3)를 의미합니다. f, 표시된 농도의 TH9619 및 TH9975 또는 50nM MTX(RPMI-FBS에서 배양)로 24시간 동안 처리된 SW620 WT, MTHFD2-/- 및 SHMT1-/- 세포의 [U-13C] 세린 유래 포름산염 방출 속도 는 ± sd를 의미합니다(제어 및 TH9619의 경우 n = 3, TH9975의 경우 n = 2, MTX의 경우 n = 1). Tukey의 다중 비교 테스트를 사용한 일원 분산 분석(분산 분석). g, 48시간 동안 1μM의 TH9619 또는 TH9975 또는 0.5μM MTX로 처리된 SW620 WT 세포에서 미토콘드리아 막 전위의 정량화. FCCP는 양성 대조군으로 사용되었습니다. 데이터는 평균 ± sd(FCCP의 경우 n = 4, n = 5)로 표시됩니다. 다중 비교를 위한 Dunnett 테스트를 사용한 일원 분산 분석. h, i, 10μM TH9619 또는 비히클로 3시간 동안 처리된 SW620 WT 세포의 MTHFD2 안정화에 대한 CETSA 분석. MTHFD2 안정화는 남은 MTHFD2 신호를 미토콘드리아 분획(h)의 HSP60 또는 핵 분획(i)의 라민 A/C로 정규화하여 웨스턴 블롯으로 평가했습니다. j, 두 개의 독립적인 실험 중 하나의 대표적인 면역블롯. k, 10μM TH9619 또는 비히클과 함께 30분 동안 배양한 SW620 용해물의 MTHFD1 안정화에 대한 DARTS 분석, 이어서 증가하는 프로나제 농도에서 단백질 소화 및 웨스턴 블롯에 의한 MTHFD1 분해 평가. MTHFD1 신호는 SOD1로 정규화되었습니다. 세 가지 독립적인 실험 중 대표적인 것이 표시됩니다. l, MTHFD1(DC) WT 또는 MTHFD1(DC) 돌연변이(Q100A)에 대한 억제 활성에 대해 평가된 표시된 MTHFD1/2 억제제에 대한 평균 pIC50(최대 억제 농도의 절반 로그) 값, 평균(왼쪽에서 오른쪽으로 n = 4, 9, 2, 19, 5, 15, 5, 6, 4, 8); 짝이 없는 양측 t-검정. m, MTHFD1-Q100A용 CRISPR-Select 카세트가 SW620 세포에 전달되었습니다. 그래프는 2일차 값으로 표준화된 10μM TH9619 처리의 2일차 및 25일차에 MTHFD1-Q100A 대 WT의 비율을 보여줍니다. 평균 ± sd(n = 4); 쌍을 이루는 양측 t-검정.